Методические аспекты определения окислительной модификации белка

Методические аспекты определения окислительной модификации белка

Н.В. Вавилов, Ю.И. Шилов, А.П. Годовалов
Ключевые слова: белок, окислительная модификация белка, свободные радика лы, микрометод, 2,4-динитрофенилгидразин, карбонильные группы.
Медицинский Альманах, 2018, номер 2, стр. 19-22.

Полный текст статьи

pdf

Введение. К настоящему времени накоплено большое количество данных об оксидативном
стрессе, его индукторах и о его влиянии на человеческий организм. В настоящей статье рассмо-
трены основные изменения белковых молекул под влиянием продуктов окислительного стресса
и произведён краткий обзор основных методов обнаружения модифицированных белков. Цель
исследования: подбор некоторых методических подходов к определению уровня окислитель-
ной модификации белка сыворотки крови. Материал и методы. Предложена модификация ме-
тода Reznick et al. для определения окислительной модификации белка в микроварианте, суть
которой состоит в пропорциональном снижении объёмов реагентов-участников реакции и в за-
мене некоторых реактивов на их аналоги по химической природе. Результаты исследования.
Концентрация кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера (кДНФн) сыворотки пе-
риферической крови здоровых доноров составила 1,24±0,15, кетон-динитрофенилгидразонов основ-
ного характера (кДНФо) – 0,74±0,11, а альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера
(аДНФн) – 0,37±0,07 нмоль/мг белка. Общая суммарная концентрация окисленных белков сыво-
ротки периферической крови здоровых доноров составила 2,35±0,11 нмоль/мг белка. Выявлено,
что на долю аДНФн приходится 16%, на долю кДНФо – 31,5%, на долю кДНФн – 52,5% окислен-
ных белков. Таким образом, соотношение окисленных белков сыворотки крови здоровых доноров
кДНФн : кДНФо : аДНФн составляет 1 : 2 : 3,3. Заключение. В ходе проведения исследований было
установлено, что при определении уровня окисленного белка микрометодом уровень окисленных
белков соответствует результатам, полученным как в классическом варианте реакции, так и данны-
ми литературы.

1. Berlett B.S., Stadtman E.R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative
stress. J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 20313-20316.
2. Davies K. J. Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochem. Soc. Symp.
1995. Vol. 61. P. 1-31.
3. Floyd R.A., Carney J.M. Free radical damage to protein and DNA: mechanisms
involved and relevant observations on brain undergoing oxidative stress. Ann.
Neurol. 1992. Vol. 32. P. 22-27.
4. Valko M., Morris H., Cronin M.T. Metals, toxicity and oxidative stress. Curr.
Med. Chem. 2005. Vol. 12. P. 1161-1208.
5. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в био-
логических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.
6. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D. et al. Protein carbonyl groups as
biomarkers of oxidative stress. Clinica Chimica Acta. 2003. Vol. 329. P. 23-38.
7. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine Oxford,
UK: Oxford University Press. 1999. 452 p.
8. Wolff S.P., Dean R.T. Fragmentation of proteins by free radicals and it’s
effect on their susceptibility to enzymic hydrolysis. J. Biochem. 1986. Vol. 234(2).
Р. 399-403.
9. Eftink M.R. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions
in proteins. Biochem. 1998. Vol. 63. P. 276-284.
10. Davies K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. J. Biol. Chem.
1987. Vol. 262 (20). Р. 9895-9901.
11. Weigele M., De Barnardo S.L., Tengi J.P., Leimgruber W. A novel reagent
for the fluorometric assay of primary amines. J. Am. Chem. Soc. 1972. Vol. 94.
P. 5927-5928.
12. Smith R. E., Mac Quarrie R. A. Sensitive fluorometric method for the
determination of arginine using 9,10-phenanthrenequinone. Anal. Biochem. 1978.
Vol. 90. P. 246-255.
13. Pankhurst G., Wang X.L. Wilcken D.E. et al. Characterization of specifically
oxidized apolipoproteins in mildly oxidized high density lipoprotein. J. Lipid Res.
2003. Vol. 44. P. 349-355.
14. Sharov V.S., Dremina E.S., Galeva N.A. et al. Quantitative mapping of oxidationsensitive
cysteine residues in SERCA in vivo and in vitro by HPLC-electrospray-tandem
MS: selective protein oxidation during biological aging. J. Biochem. 2006. Vol. 394.
P. 605-615.
15. Lenz A., Costabel U., Shaltiel S., Levine L. Determination of carbonyl groups in
oxidatively modified proteins by reduction with tritiated sodium borohydride. Anal.
Biochem. 1989. Vol. 177. P. 419-425.
16. Боев К.В., Василенко Д.В., Маслов А.И. Свободно-радикальное окисле-
ние белков: методологические аспекты количественной оценки окислительной
модификации по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Universum: Химия
и биология: электрон. научн. журн. 2014. Т. 1 (2). С. 4-6.
17. Levine R.L., Carland D., Oliver C.N., Amici A. Determination of carbonyl content
in oxidatively modified proteins. Methods Ensimology. 1990. Vol. 186. P. 464-78.
18. Дубинина Е.Е., Гавровская С.В., Кузьмич Е.В. и др. Окислительная моди-
фикация белков: окисление триптофана и образование в очищенных белках с
использованием системы Фентона. Биохимия. 2002. Т. 67. С. 413-421.
19. Reznick A.Z., Packer L. Oxidative Damage to Proteins: Spectrophotometric
Method for Carbonyl Assay. Methods in enzymology. 1994. Vol. 233. P. 357-363.
20. Gladstone Jr.I.M., Levine R.L. Oxidation of proteins in neonatal lungs.
Pediatrics. 1994. Vol. 93 (5). P. 764 -768.
21. Conrad C.C., Choi J., Malakowsky C.A. et al. Identification of protein carbonyls
after twodimensional electrophoresis. Proteomics. 2001. Vol. 1. P. 829-834.
22. Buss I.H., Chan T.P., Sluis K.B. et al. Protein carbonyl measurement by a
sensitive ELISA method. Free Radic. Biol. Med. 1997. Vol. 23 (3). P. 361-367.
23. Вавилов Н.В., Шилов Ю.И. Модификация метода оценки окислительной
модификации белков. Медицинская иммунология. 2017. Т. 19 (V). С. 254.
24. Копытова Т.В., Пантелеева Г.А., Дмитриева О.Н., Коткова Е.В. Оценка
окислительной модификации белков у больных хроническими распространён-
ными дерматозами. Клиническая лабораторная диагностика. 2014. Т. 2. С. 41-44.
Kopytova T.V., Panteleeva G.A., Dmitrieva O.N., Kotkova E.V. Ocenka
okislitel'noj modifikacii belkov u bol'nyx xronicheskimi rasprostranyonnymi
dermatozami. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2014. Vol. 2. S. 41-44.
25. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurement
with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.
26. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal.
Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
27. Ruth F., Itzhaki D.M. A micro-biuret method for estimating proteins. Anal.
Biochem. 1964. Vol. 9. P. 401-410.
28. Sheth J.J., Shah U.J., Sheth F.J. et al. Genoprotective Effect of Indian Gentian
in Type 2 DiabetesMellitus (T2DM): Comet Assay, Sister Chromatid Exchange and
Protein Oxidation Studies. Kamla-Raj Enterprises. 2011. Vol. 11. P. 83-88.

N.V. Vavilov, Yu.I. Shilov, А.P. Godovalov Methodical aspects of determining the oxidative modification of the protein. Medicinskij al'manah 2018; (2): 19–22, http://dx.doi.org/10.21145/2499-9954-2018-2-19-22